Moving average imagej

Image Intensity Processing Kecerahan adalah persepsi visual cahaya yang dipantulkan. Kecerahan yang meningkat mengacu pada gambar yang meningkatkan luminance. Kontras adalah pemisahan bagian yang paling terang dan paling gelap dari sebuah gambar. Peningkatan kontras akan menggelapkan bayangan dan menyoroti sorotan. Meningkatnya kontras umumnya digunakan untuk membuat objek dalam gambar lebih bisa dibedakan. Sesuaikan kecerahan dan kontras dengan Image Adjust BrightnessContrast. Untuk membuat visualisasi gambar lebih mudah. Tekan tombol Auto untuk menerapkan peregangan kontras cerdas ke tampilan gambar. Kecerahan dan kontras disesuaikan dengan memperhatikan histogram gambar. Jika ditekan berulang kali, tombol akan meningkatkan persentase piksel jenuh. Tombol Reset membuat maksimum 0 dan 255 minimum dalam gambar 8-bit dan maksimum dan minimum sama dengan nilai piksel terkecil dan terbesar dalam gambar histogram untuk gambar 16-bit. Jika tombol Auto tidak menghasilkan hasil yang diinginkan, gunakan alat kawasan-minat (ROI) untuk memilih bagian sel dan beberapa latar belakang, lalu tekan tombol Auto lagi. Peregangan kemudian akan didasarkan pada intensitas ROI. Menekan tombol Apply secara permanen akan mengubah nilai abu-abu sebenarnya dari gambar. Jika hanya menganalisa intensitas gambar jangan menekan tombol ini. Jika Anda lebih memilih gambar yang akan ditampilkan sebagai warna hitam putih daripada putih pada warna hitam, gunakan perintah terbalik: Tabel Lookup Gambar Balikkan Lut. Perintah Edit Invert membalikkan nilai pixel itu sendiri secara permanen. Mendapatkan nilai intensitas dari ROI tunggal Jika bekerja dengan stack, ROI yang dipilih dapat dianalisis dengan perintah: Image Stacks Plot Z Axis Profile. Ini menghasilkan satu kolom angka - satu irisan intensitas per baris. 6 baris teratas kolom adalah rincian ROI. Ini memastikan ROI yang sama tidak dianalisis dua kali dan memungkinkan Anda untuk menyimpan ROI yang menarik. Rinciannya terdiri dari area, koordinat x, y-koordinat, AR, kebulatan, dan soliditas ROI. Jika ROI adalah ROI polylinegtfreehand daripada squaregtoval, ia bertindak seolah-olah ROI adalah ovalgtsquare. ROI (oval) dapat dipulihkan dengan memasukkan rincian yang diminta oleh perintah Edit Selection Restore Selection (hotkey: Ctrl Shift E). Hasilnya ditampilkan di jendela plot dengan detail ROI pada judul jendela plot. Plot berisi tombol Daftar, Simpan, Salin. Tombol Copy menempatkan data di clipboard sehingga bisa disisipkan ke dalam lembar Excel. Pengaturan untuk tombol salin dapat ditemukan di bawah Opsi Pilihan Edit Profil Pilihan. Pengaturan yang disarankan meliputi: Jangan simpan nilai x (mencegah data jumlah slice disisipkan ke Excel) dan Autoclose sehingga Anda tidak perlu menutup plot yang dianalisis setiap saat. Dynamic intensity vs Time analysis Plugin Plot Z Axis Profile (ini adalah Z Profiler dari Kevin (Gali) Baler (gliblr at yahoo) dan Wayne Rasband berganti nama) akan memantau intensitas ROI yang bergerak dengan menggunakan alat pelacak partikel. Alat ini bisa manual atau otomatis. Gunakan perintah Image Stacks Plot Z Axis Profile. Mendapatkan nilai intensitas dari beberapa ROI Anda dapat menganalisis beberapa ROI sekaligus dengan plugin Bob Doughertys Multi Measure. Fungsi manajer ROI asli melakukan pekerjaan serupa kecuali doesnt menghasilkan hasil dalam kolom yang diurutkan. Periksa situs web Bobs untuk mendapatkan pembaruan. Plugin Multi Measure yang disertakan dengan instalasi adalah v3.2. Buka confocal-series dan hapus latar belakangnya (Lihat koreksi Latar Belakang) Buat tumpukan referensi untuk penambahan ROI. Gunakan fungsi Tumpukan Gambar Tumpukan dan pilih Rata-rata. Ubah nama gambar ini sesuatu yang berkesan. Buka plugin Manajer ROI (Analyze Tools Roi Manager atau ikon toolbar). Pilih ROIs dan Add to the ROI manager. Klik tombol Tampilkan Semua untuk membantu menghindari analisis sel yang sama dua kali. Setelah memilih ROI untuk dianalisis dalam gambar referensi, Anda dapat menarik mereka ke gambar referensi dengan mengklik tombol Moregtgt dan memilih Draw. Simpan gambar referensi ke folder data percobaan dan kemudian klik pada tumpukan yang akan dianalisis. Klik tombol Moregtgt di manajer ROI dan pilih tombol Multi Measure untuk mengukur semua ROI. Klik Ok. Ini akan menempatkan nilai dari masing-masing slice ke satu baris dengan beberapa kolom per slice. Mengklik Ukur semua 50 irisan akan menempatkan semua nilai dari semua irisan dan setiap ROI dalam satu kolom. Buka jendela Results dan pilih item menu Edit Select All. . Lalu EditCopy. Pergi ke Excel dan paste di data. Periksa apakah semuanya telah disisipkan dengan benar 10. Untuk menyalin koordinat ROI ke dalam spreadsheet Excel, perlu ada baris kosong di atas data intensitas. Gunakan dialog Multi Measure dan klik tombol Copy list. 14. Di Excel, klik sel kosong di atas kolom data pertama dan paste di koordinat ROI. Simpan ROI dengan tombol Multi Measure Save. Masukkan mereka ke folder data eksperimen. ROI dapat dibuka nanti baik secara individual dengan tombol Open atau sekaligus dengan tombol Open All. ROI oval dan persegi panjang dapat dipulihkan secara terpisah dari nilai x, y, l, h dengan ROI Plugins Tentukan ROI. perintah. Ratiometric imaging membandingkan rekaman dua sinyal yang berbeda untuk melihat apakah ada kesamaan di antara keduanya. Hal ini dilakukan dengan membagi satu saluran dengan saluran lain untuk menghasilkan kanal ratiometrik ketiga. Teknik ini berguna karena mengoreksi kebocoran zat warna, pemuatan zat warna yang tidak merata, dan pemutihan foto. Contoh aplikasi akan mengukur ion intraseluler, pH, dan dinamika tegangan secara real time. Pengurangan latar belakang diperlukan sebelum analisis citra rasio dual-channel. Lihat juga bagian koreksi latar belakang. Plugin RatioProfiler akan melakukan analisis ratiometrik ROI tunggal pada tumpukan interleaved dual-channel. Irisan aneh adalah gambar saluran 1 dan bahkan irisan adalah gambar saluran 2. Jika dua saluran Anda dibuka sebagai tumpukan terpisah, seperti Zeiss, kedua saluran dapat disisipkan (digabungkan bersamaan dengan bergantian di antara keduanya) dengan perintah menu Plugins Stacks - Shuffling Stack Interleaver. Plugin akan menghasilkan plot hijau dari nilai rasio. Ch1Ch2 adalah default dan Anda bisa mendapatkan Ch2Ch1 jika plugin dijalankan dengan tombol Alt ke bawah. Ini juga akan menghasilkan alur kedua dari intensitas masing-masing saluran, Ch1 dan Ch2, serta tabel hasil. Baris pertama dari tabel hasil berisi nilai untuk x, y, lebar dan tinggi ROI. Dari baris kedua ke bawah, kolom pertama adalah waktu (nomor slice), kolom kedua adalah intensitas rata-rata Ch1, dan kanal ketiga adalah intensitas rata-rata Ch2 dan nilai rasionya. Tumpukan harus memiliki interval frame yang dikalibrasi agar nilai Time berada dalam hitungan detik. Jika tidak, itu adalah irisan. Interval frame dapat diatur untuk stack melalui perintah menu Image Properties. Tabel ini dapat disalin ke clipboard dan disisipkan di tempat lain dengan perintah Edit Copy All menu. Analisis Rasio Dengan menggunakan manajer ROI 1. Ekstrak latar belakang dari gambar. 2. Buka manajer ROI (manajer Analyze Tools ROI.) Dan klik tombol Tampilkan Semua. 3. Pilih sel yang akan dianalisis dan tambahkan ke manajer ROI (tombol Add atau tombol keyboard T). 4. Jalankan plugin. Jendela hasil berisi mean ch1 dan ch2 dan rasionya. Setiap baris adalah timepoint (slice). Baris pertama berisi rincian ROI. Untuk menghasilkan gambar referensi: Ratakan tumpukan dengan perintah menu (Image Stacks Z-project dengan tipe Proyeksi: Maksimum), Sesuaikan kecerahan dan kontras jika perlu. Pilih gambar baru dan klik tombol More di manajer ROI. Setelah itu pilih Label. Mendapatkan data timestamp The LSM Toolbox adalah sebuah proyek yang bertujuan mengintegrasikan fungsi umum yang berguna di seputar format file LSM Zeiss, yang seharusnya meningkatkan kegunaan file LSM confocal yang tersimpan dalam format aslinya, sehingga melestarikan semua metadata yang ada. Di Fiji, perintah yang sesuai adalah: File Import Show LSMToolbox yang menampilkan kotak peralatan, dari mana semua perintah dapat dipanggil dan Help About Plugins LSMToolbox. Yang menampilkan informasi tentang plugin. Membaca ini bisa ditemukan dengan menggunakan perintah menu Image Show Info. . Gulir ke bawah untuk mendapatkan waktu setiap irisan diperoleh. Pilih waktu ini, salin ke Excel, dan cari nomor waktu yang didapat dengan menggunakan perintah menu Excel Edit Replace. Ini hanya akan menyisakan waktu data. Waktu yang telah berlalu kemudian dapat dihitung dengan mengurangkan baris 1 dari semua baris berikutnya. Linescanning melibatkan perolehan satu baris, satu piksel lebarnya, dari mikroskop confocal umum, bukan gambar 2D standar. Ini biasanya cara yang lebih cepat untuk mengambil gambar. Semua gambar single pixel-wide kemudian ditumpuk untuk menciptakan gambar 2D. Generasi pseudo-linescan dari gambar 3-D (x, y, t). Hal ini berguna untuk menampilkan data 3-D dalam 2 dimensi. Sebuah garis bunga ditarik diikuti oleh perintah: Image Stacks Reslice atau dengan tombol keyboard. Ini akan menanyakan lebar garis yang ingin Anda rangkum. Ini akan menghasilkan tumpukan pseudo-linescan dengan setiap irisan yang mewakili pseudo-linescan dari garis lebar satu piksel di sepanjang garis ketertarikan. Rata-rata tumpukan pseudo-lines dapat dipilih dengan memilih Image Stacks Z-Project. Dan gunakan perintah Average. Sebuah poli-line dapat digunakan, tapi ini hanya akan menghasilkan satu irisan piksel tunggal. Pengaturan default Fijis berasumsi bahwa tumpukan adalah z - series dan bukan t - series. Ini berarti bahwa banyak fungsi yang berkaitan dengan dimensi ketiga dari tumpukan gambar disebut dengan z-. Ingatlah ini. Analisis FRAP (Pemulihan Fluoresensi Setelah Memotret) Analisis plugin profiler FRAP akan menganalisis intensitas ROI yang dikelantang dari waktu ke waktu dan menormalkannya terhadap intensitas keseluruhan sel. Setelah itu akan menemukan intensitas minimum ROI yang dikelantang dan sesuai dengan pemulihan dengan pemikiran ini. Buka pengelola ROI. Gambarlah sekitar ROI yang dikelantang dan tambahkan ke pengelola ROI. Gambarlah seluruh sel dan tambahkan itu ke manajer ROI. Normalisasi memperbaiki pemutihan yang terjadi selama perolehan gambar dan mengasumsikan keseluruhan sel berada di bidang pandang. Plugin mengasumsikan yang lebih besar dari dua ROI di manajer ROI adalah keseluruhan ROI sel dan ROI yang lebih kecil adalah bagian yang dikelantang. Jalankan plugin profiler FRAP. Plugin akan mengembalikan intensitas vs plot waktu, intensitas waktu yang dinormalisasi vs plot waktu area yang dikelantang, dan kurva yang sesuai. Kontras kontras non linier Persamaan Anda dapat memiliki kontrol yang lebih besar terhadap penyesuaian kecerahan dan kontras dengan perintah menu Proses Enhance contrast. Dengan setumpuk, ia menganalisa setiap histogram irisan untuk membuat penyesuaian. Perintah kontras Equalize menerapkan histogram non linier histogram berdasarkan akar kuadrat dari intensinya. Gamma melakukan penyesuaian histogram non linier. Objek samar menjadi lebih intens sedangkan objek terang tidak (gamma lt1). Selain itu, objek intensitas sedang menjadi redup sedangkan objek terang tidak (gamma gt 1). Intensitas masing-masing pixel dinaikkan ke kekuatan nilai gamma dan kemudian diskalakan menjadi 8-bit atau min dan max dari gambar 16 bit. Untuk gambar 8 bit Intensitas baru 255 (intensitas cahaya255) gamma Gamma dapat disesuaikan melalui perintah Gamma Proses Matematika. Ini akan memungkinkan Anda mengatur gamma dengan scroll bar. Klik Ok setelah selesai. Anda dapat menggunakan Gulir-bar untuk menentukan nilai gamma yang diinginkan pada satu irisan tumpukan Anda. Ada juga pilihan untuk melihat pratinjau hasilnya. Lihat referensi online untuk penjelasan tentang filter digital dan bagaimana penggunaannya. Filter dapat ditemukan dengan menggunakan perintah menu Process Filters. . Filter berarti Pixel diganti dengan rata-rata dirinya dan tetangganya dalam radius yang ditentukan. Item menu Process Smooth adalah 33 mean filter. Gaussian filter Ini mirip dengan filter pemulusan namun menggantikan nilai piksel dengan nilai yang sebanding dengan distribusi normal tetangganya. Filter median Nilai pixel diganti dengan median itu sendiri dan tetangga yang berdekatan. Ini menghilangkan kebisingan dan menjaga batas lebih baik daripada penyaringan rata-rata sederhana. Item menu Process Noise Despeckle adalah 33 median filter. Convolve filter: Hal ini memungkinkan dua susunan angka untuk dikalikan bersama. Array dapat ukuran yang berbeda tetapi harus memiliki dimensi yang sama. Dalam analisis citra, proses ini umumnya digunakan untuk menghasilkan citra keluaran dimana nilai pixel adalah kombinasi linear dari nilai input tertentu. Minimal: Filter ini, juga dikenal sebagai filter erosi, adalah filter morfologi yang mempertimbangkan lingkungan sekitar piksel dan, dari daftar tetangga ini, menentukan nilai minimum. Setiap pixel pada gambar tersebut kemudian diganti dengan nilai yang dihasilkan oleh masing-masing lingkungan. Maksimum: Filter ini, juga dikenal sebagai filter pelebaran, adalah filter morfologi yang mempertimbangkan lingkungan sekitar setiap piksel dan, dari daftar tetangga ini, menentukan nilai maksimum. Setiap pixel pada gambar tersebut kemudian diganti dengan nilai yang dihasilkan oleh masing-masing lingkungan. Filter Kalman Filter ini, yang juga dikenal sebagai Estimasi Kuadrat Linear, beroperasi secara rekursif pada input yang bising untuk menghitung perkiraan kondisi sistem yang mendasar secara statistik. Koreksi latar belakang bisa dilakukan dengan berbagai cara. Metode sederhana adalah dengan menggunakan Tabel Gambar Lookup HiLo LUT untuk menampilkan nilai nol sebagai nilai biru dan putih (nilai piksel 255) sebagai warna merah. Dengan latar belakang yang relatif bahkan di seluruh gambar, lepaskan dengan perintah BrightnessContrast dengan perlahan menaikkan nilai Minimum sampai sebagian besar latar belakang ditampilkan biru. Tekan tombol Apply untuk membuat perubahan permanen. Koreksi latar belakang Rolling-Ball Untuk memperbaiki latar belakang yang tidak rata gunakan perintah menu Process Subtract background. Ini akan menggunakan algoritma rolling ball pada latar belakang yang tidak rata. Jari-jarinya harus diatur setidaknya seukuran objek terbesar yang bukan bagian dari latar belakang. Hal ini juga dapat digunakan untuk menghilangkan latar belakang dari gel dimana latar belakang berwarna putih. Menjalankan perintah beberapa kali bisa menghasilkan hasil yang lebih baik. Pengguna dapat memilih apakah memiliki latar belakang yang terang atau tidak, membuat latar belakang tanpa pengurangan, memiliki paraboloid geser, menonaktifkan smoothing, atau melihat pratinjau hasilnya. Nilai default untuk radius bola bergulir adalah 50 piksel. Proses Mengurangi Latar Belakang. Patologi Tapak Menginduksi Kerusakan Neuron Istimewa, Disfungsi Memori Grid, dan Defisit Memori Spasial Mengingatkan Penyakit Alzheimer Awal Hongjun Fu 1.4 Gustavo A. Rodriguez 1.4 Mathieu Herman 1 Sheina Emrani 1 Eden Nahmani 1 Geoffrey Barrett 1 Helen Y Figueroa 1 Eliana Goldberg 1 S. Abid Hussaini 1,2,4,. Karen E. Duff 1,2,3,5,. 1 Institut Taub untuk Penelitian tentang Penyakit Alzheimer dan Otak Penuaan, Pusat Kesehatan Universitas Columbia, New York, NY 10032, AS 2 Departemen Patologi dan Biologi Sel, Pusat Kesehatan Universitas Columbia, New York, NY 10032, AS 3 Departemen Integratif Neuroscience , Institut Psikiater New York State, New York, NY 10032, USA Diterima pada 20 Juli 2016. Direvisi pada 20 Oktober 2016. Diterima pada tanggal 15 Desember 2016. Tersedia secara online 19 Januari 2017. Diterbitkan: 19 Januari 2017 Ikhtisar Tau patologi menginduksi defisit memori spasial yang lama , Tapi tidak muda, tikus EC-Tau Tikus Aged EC-Tau menunjukkan hipoaktivitas sel grid dan mengurangi periodisitas. Runtutan, tapi tidak menghambat, neuron MEC rentan terhadap patologi tau Aktivitas neuron yang berubah berkorelasi dengan neurodegenerasi pada EC-Tau tua Tahap awal Alzheimer Penyakit (AD) ditandai dengan pembentukan kusut dewasa di korteks entorhinal dan disorientasi dan kebingungan saat menavigasi tempat yang familier. Korteks entorhinal medial (MEC) berisi neuron khusus yang disebut sel grid yang merupakan bagian dari sistem navigasi spasial. Di sini kita menunjukkan pada model tikus transgenik yang mengekspresikan manusia mutan yang paling banyak didengar di Komisi Eropa bahwa pembentukan kecacatan dewasa pada tikus tua dikaitkan dengan kehilangan sel rangsang dan defisit dalam fungsi sel grid, termasuk bidang grid yang tidak stabil dan tingkat tembakan yang rendah, serta Mengubah aktivitas jaringan Overt tau patologi pada tikus umur tersebut disertai dengan defisit memori spasial. Oleh karena itu, patologi tau yang dimulai di korteks entorhinal dapat menyebabkan defisit dalam penembakan sel grid dan mendasari kemerosotan kognisi spasial yang terlihat pada manusia AD. Tau patologi Penyakit Alzheimer sel korteks entorhinal grid neuronal loss defisit kognitif neurofibrillary kusut memori spasial elektrofisiologi hipoaktivitas Gambar 1. Gambar 2. Gambar 3. Gambar 4.November 04, 2010 Informasi berikut adalah versi terbaru dari metode untuk menggunakan ImageJ untuk menganalisis barat Noda dari halaman lama yang sudah usang. Jika Anda mencari opsi alur kerja yang lebih komprehensif untuk analisis western blot Anda, silakan kunjungi tutorial saya tentang cara menggunakan Image Studio Lite. Paket perangkat lunak bebas dari LI-COR Biosciences. Perangkat lunak Image Studio Lite dapat didownload secara gratis dari licorislite. Selain fungsi yang dijelaskan di bawah ini untuk ImageJ, Image Studio Lite menyediakan fitur pengelolaan data tambahan beserta anotasi alat untuk menghasilkan gambar siap publikasi dari western Anda. ImageJ (rsb. info. nih. govijindex. html) dapat digunakan untuk membandingkan densitas (aka intensitas) band pada gel agar atau western blot. Tutorial ini mengasumsikan bahwa Anda telah membawa gel atau blot Anda melalui langkah visualisasi, sehingga Anda memiliki gambar digital gel Anda di. tif. Jpg Png atau format gambar lainnya (format 16 bit. tif adalah format pilihan untuk menyimpan jumlah maksimum informasi dalam gambar asli). Jika Anda memindai film x-ray pada pemindai flatbed, pastikan Anda menggunakan pemindai dengan kemampuan memindai transparansi (misalnya film), dan gunakan perangkat lunak pemindai untuk menyimpan gambar tiff 16-bit. Lihat referensi di akhir tutorial ini untuk pembahasan berbagai cara agar Anda bisa mengimbangi langkah ini. Ini juga mengasumsikan bahwa Anda tidak memotret gambar blot Anda saat Anda memproduksinya. Untuk penjelasan mengapa overexposure akan merusak hasil Anda, lihat halaman ini. Metode yang diuraikan di sini menggunakan metode Analisis Gel yang digariskan dalam dokumentasi ImageJ: Analisis Gel. Anda mungkin lebih suka menggunakannya daripada metode yang saya garis bawahi di bawah ini. Harus ada sedikit perbedaan antara hasil yang didapat dari berbagai metode. Versi tutorial ini dibuat dengan menggunakan ImageJ 1.42q pada instalasi Windows 7 64-bit. 1. Buka file gambar menggunakan FilegtOpen di ImageJ. 2. Rutin analisa gel mengharuskan gambar menjadi gambar skala abu-abu. Metode paling sederhana untuk mengkonversi ke grayscale adalah pergi ke ImagegtTypegt8-bit. Gambar Anda akan terlihat seperti Gambar 1. Gambar 1. Gambar blot buatan dibuat dibuka di ImageJ. Informasi di sepanjang bagian atas gambar menunjukkan bahwa gambar saat ini dalam mode 8-bit, menggunakan LUT pembalik (tabel tampilan). LUT pembalik memastikan bahwa pita gelap akan dicatat sebagai nilai kerapatan yang lebih tinggi. 3. Pilih alat Rectangular Selections dari toolbar ImageJ. Gambarlah sebuah persegi panjang di sekitar jalur pertama. ImageJ mengasumsikan bahwa jalur Anda berjalan secara vertikal (sehingga masing-masing band horizontal), jadi persegi panjang Anda harus tinggi dan sempit untuk melampirkan satu jalur. Jika Anda menggambar persegi panjang yang pendek dan lebar, ImageJ akan beralih ke asumsi jalur yang berjalan horizontal (masing-masing band vertikal), yang menyebabkan banyak kebingungan. Gambar 2. Jalur pertama telah dipilih dengan alat Rectangular Selections 4. Setelah menggambar persegi panjang di atas jalur pertama Anda, tekan tombol 1 (Command 1 on Mac) (Command 1 on Mac) atau masuk ke AnalyzegtGelsgtSelect First Lane untuk mengatur Persegi panjang di tempat Jalur pertama sekarang akan disorot dan ada 1 di tengahnya. 5. Gunakan mouse Anda untuk mengeklik dan tahan di tengah kotak pada jalur pertama dan seret ke jalur berikutnya. Anda juga bisa menggunakan tombol panah untuk menggerakkan persegi panjang, meski ini lebih lambat. Pusat persegi panjang di atas jalur kiri-ke-kanan, tapi jangan khawatir tentang melapisinya dengan sempurna pada sumbu vertikal yang sama. Image-J secara otomatis akan menyelaraskan persegi panjang pada sumbu vertikal yang sama dengan persegi panjang pertama pada langkah berikutnya. 6. Tekan 2 (Command 2 on Mac) atau masuk ke AnalyzegtGelsgtSelect Next Lane untuk mengatur persegi panjang di tempat di atas jalur ke-2. A 2 akan muncul di jalur saat persegi panjang ditempatkan. 7. Ulangi Langkah 5 6 untuk setiap jalur berikutnya pada gel, tekan 2 (Command 2 on Mac) setiap kali mengatur persegi panjang di tempat (Gambar 3). Gambar 3. Letakkan persegi panjang di atas setiap jalur, tekan 2 setiap kali untuk mengatur kotak pada tempatnya. 8. Setelah Anda mengatur kotak di tempat pada jalur terakhir (dengan menekan 2), tekan 3 (Command 3 on Mac), atau pergi ke AnalyzegtGelsgtPlot Lanes untuk menggambar plot profil dari setiap jalur. Gambar 4. Plot profil dari contoh western blot. 9. Plot profil mewakili kerapatan relatif isi persegi panjang di atas setiap jalur. Kotak-kotak itu disusun dari atas ke bawah pada plot profil. Pada contoh gambar western blot, puncak pada plot profil (Gambar 4) sesuai dengan pita gelap pada gambar asli (Gambar 3). Karena ada empat jalur yang dipilih, ada empat bagian dalam plot profil. Puncak yang lebih tinggi merupakan band yang lebih gelap. Puncak yang lebih lebar mewakili band yang mencakup rentang ukuran yang lebih luas pada gel aslinya. 10. Gambar gel asli atau western blots akan selalu memiliki beberapa sinyal latar belakang, jadi puncaknya tidak sampai ke garis dasar plot profil. Gambar 5 menunjukkan puncak dari noda nyata dimana ada beberapa kebisingan latar belakang, sehingga puncaknya melayang di atas garis dasar plot profil. Perlu menutup puncak sehingga kita bisa mengukur ukurannya. Gambar 5. Ubin barat yang sebenarnya sering memiliki beberapa kebisingan latar belakang, sehingga puncaknya tidak sampai ke garis dasar (putih sempurna). 11. Pilih alat seleksi Lurus dari toolbar ImageJ (Gambar 6). Untuk setiap puncak yang ingin Anda analisis di plot profil, gambarlah garis di dasar puncak untuk menutupi puncak (Gambar 5). Langkah ini memerlukan pertimbangan subyektif dari pihak Anda untuk menentukan di mana puncaknya berakhir dan kebisingan latar belakang dimulai. Gambar 6. Gunakan alat garis lurus untuk menutup dasar setiap puncak bunga. Gambar 7. Puncak dari Gambar 5 ditunjukkan dengan garis yang ditarik melintasi dasar puncak untuk melampirkan area puncak. 12. Perhatikan bahwa jika Anda memiliki banyak jalur yang disorot, jalur selanjutnya akan disembunyikan di bagian bawah jendela petak profil. Untuk melihat jalur ini, tekan dan tahan spasi, dan gunakan mouse untuk mengklik dan tarik plot profil ke atas. 13. Saat setiap puncak ditutup di pangkalan dengan alat seleksi Lurus, pilih alat Wand dari toolbar ImageJ (Gambar 8). Gambar 8. Pilih alat Wand untuk menyoroti setiap puncak minat pada plot profil. 14. Dengan menggunakan spacebar dan mouse, tarik plot profil kembali ke bawah sampai Anda kembali ke jalur pertama. Dengan alat Wand, klik di dalam puncak (Gambar 9). Ulangi ini untuk setiap puncak saat Anda turun dari plot profil. Untuk setiap puncak yang Anda sorot, pengukuran harus muncul di jendela Hasil yang muncul. Gambar 9. Klik di dalam puncak 1 bunga dengan alat Wand. Puncaknya harus disorot dan pengukuran harus muncul di jendela Results. 15. Setelah semua puncak disorot, masuk ke AnalyzegtGelsgtLabel Peaks. Label ini masing-masing puncak dengan ukurannya, dinyatakan sebagai persentase dari total ukuran semua puncak yang disorot. 16. Nilai dari jendela Hasil (Gambar 10) dapat dipindahkan ke program spreadsheet dengan memilih EditgtCopy Semua di jendela Hasil. Tempelkan nilainya ke dalam spreadsheet. Gambar 10. Keluaran dari memilih puncak di plot profil dan memberi label puncak. Dalam kasus ini, hasilnya adalah memilih pita atas di masing-masing dari 4 jalur pada contoh western blot dari Gambar 1. Catatan: Jika Anda secara tidak sengaja mengklik salah tempat dengan Wand. Program ini masih mencatat area yang diklik sebagai puncak, dan akan menjadi faktor ke dalam total area yang digunakan untuk menghitung nilai persentase. Jelas ini akan mengurangi hasil Anda jika Anda mengklik area yang tidak terangkat. Jika Anda kebetulan mengklik di tempat yang salah, cukup masuk ke AnalyzegtGelgtLabel Peaks untuk merencanakan hasil saat ini, yang menampilkan nilai yang salah, namun yang lebih penting me-reset meja untuk jendela Results. Kembali ke plot profil dan mulai mengklik di dalam puncak lagi, dimulai dengan puncak 1 minat. Jendela Hasil harus jelas dan mulai menunjukkan nilai baru Anda. Bila Anda benar-benar mengklik semua puncak yang benar tanpa sengaja mengklik area yang salah, Anda dapat kembali ke AnalyzegtGelsgtLabel Peaks dan mendapatkan hasil yang benar. Analisis data Dengan data Anda disisipkan ke dalam spreadsheet, Anda sekarang dapat menghitung kerapatan relatif puncak. Sebagai pengingat, nilai yang dihitung oleh ImageJ pada dasarnya adalah nomor yang sewenang-wenang, namun hanya memiliki makna dalam konteks himpunan puncak yang Anda pilih pada gambar gel tunggal yang telah Anda kerjakan. Mereka tidak memiliki unit protein atau unit dunia nyata lainnya yang dapat Anda pikirkan. Prosedur normal adalah untuk mengekspresikan kerapatan pita yang dipilih relatif terhadap beberapa band standar yang juga Anda pilih selama proses ini. 1. Letakkan data Anda di spreadsheet. Salah satu puncak harus menjadi standar Anda. Dalam contoh ini kita akan menggunakan puncak pertama sebagai standar. 2. Pada kolom baru di sebelah kolom Persen, bagi nilai Persen untuk setiap sampel dengan nilai Persen untuk standar (puncak pertama dalam kasus ini, 26.666). 3. Kolom nilai yang dihasilkan adalah ukuran kerapatan relatif setiap puncak, dibandingkan dengan standar, yang jelas memiliki kerapatan relatif 1. Gambar 11. Menghitung kerapatan relatif untuk masing-masing dari 4 puncak yang disorot. Kami menggunakan Sampel 1 sebagai standar untuk gel ini. Densitas Relatif dihitung dengan membagi nilai Persen untuk setiap sampel dengan nilai Persen untuk standar. 4. Dalam contoh ini, jalur ke 2 memiliki Densitas Relatif yang lebih tinggi (1,86), yang sesuai dengan ukuran dan kegelapan pita tersebut pada gambar asli (Gambar 1). Ingatlah bahwa data ini untuk baris atas band pada gambar blot asli barat. 5. Jika Anda ingin membandingkan kepadatan sampel pada beberapa gel atau noda, Anda harus menggunakan sampel standar yang sama pada setiap gel untuk memberi referensi umum saat Anda menghitung nilai Densitas Relatif. Lihat bagian di bawah ini untuk pembahasan lebih rinci mengenai persyaratan ini. 6. Untuk menguji perbedaan yang signifikan antara perlakuan dalam percobaan, semua gel atau blot Anda perlu dipindai dan dihitung dengan menggunakan metode ini, dan nilainya akan dinyatakan dalam istilah Relative Density, atau Anda dapat mengobati Densitas Relatif. Sebagai nilai perubahan lipat (yaitu perbedaan Densitas Relatif 2 antara kontrol dan perlakuan akan menunjukkan perubahan ekspresi 2 kali lipat). Jika Anda akan menggunakan analisis teknik varians untuk menguji data Anda, Anda mungkin perlu memastikan bahwa nilai Densitas Relatif Anda terdistribusi normal dan ada homogenitas varians di antara perlakuan yang berbeda. 7. Perlu dicatat di sini bahwa beberapa peneliti membuat usaha ekstra untuk memasukkan serangkaian pengenceran serial dengan standar yang telah diketahui pada masing-masing noda. Dengan menggunakan kurva pengenceran serial dan teknik kuantifikasi yang diuraikan di atas, Anda dapat mengekspresikan sampel band Anda dalam hal picogram atau nanogram protein. Contoh yang lebih terlibat dengan menggunakan kontrol pemuatan. Kami akan menggunakan Gambar 12 sebagai blangko barat yang representatif. Pada noda ini, kita akan berpura-pura bahwa kita memasukkan empat sampel protein yang dapat direplikasi (empat lembar pipet keluar dari botol homogenat yang sama), jadi kita berharap kepadatan di setiap jalur menjadi setara. Baris atas batang akan mewakili protein kita yang diminati. Serangkaian bar yang lebih rendah akan mewakili protein pemuatan muatan kami, yang dimaksudkan untuk memastikan jumlah protein total yang sama dimuat di setiap jalur. Protein pemecah muatan ini adalah protein yang diduga diekspresikan pada tingkat konstan tanpa mempedulikan perlakuan yang diterapkan pada organisme asli, seperti aktin (walaupun banyak orang akan mempertanyakan pernyataan bahwa aktin akan dinyatakan secara ekuivalen di seluruh perawatan). Gambar 12. Contoh western blot dengan baris yang lebih rendah dari band kontrol pemuatan. Seringkali band ini akan mewakili protein yang dianggap diekspresikan secara ekuivalen pada semua perawatan, seperti aktin. Melihat Gambar 12, kami berharap dapat memuat jumlah total protein total di setiap jalur, namun setelah menjalankan lapisan barat, ukuran dan intensitas palang bawah di masing-masing jalur sangat bervariasi. Dua jalur kiri tampak setara, namun jalur ke-3 memiliki separuh kerapatan (nilai abu-abu) dibandingkan dengan jalur 12, sedangkan jalur 4 memiliki separuh kerapatan dan setengahnya dibandingkan dengan jalur 12. Karena kontrol pemuatan kita sangat berbeda, kerapatan Nilai dari rangkaian atas band mungkin tidak dapat dibandingkan secara langsung. Kami menggunakan analisis gel secara rutin untuk mengukur kerapatan dan ukuran potongan, dan menggunakan hasil dari kontrol pemuatan kami (pita bawah) untuk mengukur nilai protein yang diminati kami (pita atas). 1. Buka gambar blot barat di ImageJ. 2. Pastikan gambar dalam mode 8-bit: pergi ke ImagegtTypegt8-bit. 3. Gunakan alat persegi panjang untuk menggambar kotak di sekitar lajur keseluruhan (kedua bilah atas dan bawah disertakan. 4. Tekan 822018221 (atau Command 1 pada Mac) untuk mengatur persegi panjang. 822018221 harus muncul di tengah persegi panjang. 5. Klik dan tahan di tengah persegi panjang dan seret ke jalur 2. 6. Tekan 822028221 (Command 2 on Mac) untuk mengatur persegi panjang untuk jalur 2. Sebuah 822028221 akan muncul di tengah persegi panjang. Ulangi langkah 5 6 untuk setiap jalur berikutnya, tekan 822028221 (Command 2 on Mac) untuk mengatur persegi panjang di atas setiap jalur berikutnya (lihat Gambar 13). Gambar 13. Setiap jalur telah dipilih dengan menggerakkan persegi panjang di atasnya dan menekan 822028221 untuk mengatur Persegi empat di tempat 8. Bila Anda telah menempatkan jalur terakhir (dan menekan 822028221 untuk memasangnya di tempat), Anda dapat menekan 822038221 untuk menghasilkan sebidang jalur yang dipilih (lihat Gambar 14). Gambar 14. Profil plot masing-masing Jalur (diatur dengan jalur 1 di atas, jalur 4 di bagian bawah). Anda mungkin perlu menggulir melalui t Dia melihat semua jalurnya. 9. Plot profil pada dasarnya mewakili nilai kerapatan rata-rata di satu set irisan horizontal masing-masing jalur. Gelap yang lebih gelap akan memiliki puncak yang lebih tinggi, dan lapisan yang menutupi rentang ukuran lebih besar (kD) akan memiliki puncak yang lebih lebar. Dalam contoh western blot kami, band-band itu adalah persegi panjang yang sempurna, namun Anda akan melihat beberapa kemiringan di puncak plot profil, karena ImageJ menerapkan sedikit rata-rata nilai kerapatan saat bergerak dari atas ke bawah setiap jalur. Akibatnya, transisi tajam dari warna putih sempurna menjadi sempurna pada pita jalur 1 diterjemahkan ke dalam sedikit kemiringan pada plot profil karena rata-rata. 10. Pada urin barat ideal kami yang digunakan di sini, tidak ada kebisingan latar belakang, jadi puncaknya mencapai semua jalan sampai ke garis dasar plot profil. Di bagian barat yang sebenarnya, akan ada beberapa kebisingan latar belakang (latar belakangnya tidak akan putih sempurna), sehingga puncaknya tidak sampai pada garis dasar plot profil (lihat gambar 5 di atas). Akibatnya, setiap plot harus memiliki garis yang ditarik di dasar puncak untuk menutupnya. 11. Pilih alat seleksi Lurus dari toolbar ImageJ. Untuk setiap puncak yang ingin Anda analisis di plot profil, gambarlah garis di dasar puncak untuk menutupi puncak (Gambar 7). Langkah ini memerlukan pertimbangan subyektif dari pihak Anda untuk menentukan di mana puncaknya berakhir dan kebisingan latar belakang dimulai. 12. Bila setiap puncak bunga ditutup dengan alat garis lurus, beralihlah ke alat Wand. Kami akan menggunakan alat tongkat untuk menyoroti setiap puncak bunga sehingga Citra-J dapat menghitung sifat relatifnya. 13. Kita akan mulai dengan menyoroti band kontrol pemuatan (baris bawah) pada contoh western blot kita. Mulai dari puncak plot profil, gunakan tongkat untuk klik di dalam puncak 1 (Gambar 15). Puncaknya harus disorot setelah Anda klik di atasnya. Lanjutkan mengklik puncak pemuatan untuk jalur lainnya. Jika jalur tidak terlihat di bagian bawah plot profil, tahan bilah spasi dan klik-dan-tarik plot profil ke atas untuk menampilkan jalur yang tersisa. Gambar 15. Klik di dalam puncak pemuatan-kontrol dengan alat tongkat. Klik pada masing-masing puncak pemuatan untuk jalur yang tersisa (abaikan jalur protein ke kiri untuk saat ini). 14. Bila puncak kontrol pemuatan untuk setiap jalur telah disorot dengan tongkat sihirnya, masuk ke AnalyzegtGelgtLabel Peaks. Setiap puncak yang disorot akan diberi label dengan ukuran relatifnya yang dinyatakan sebagai persentase dari total luas semua puncak yang disorot. Anda dapat membuka jendela Hasil dan memilih EditgtCopy All untuk menyalin hasil penempatan dalam spreadsheet. Gambar 16. Nilai Luas dan Persen untuk pita pemuatan kami dari contoh western blot. Jalur 1 dan 2 sama, seperti yang kita harapkan dengan melihat pita asli pada blot barat (Gambar 12). 15. Ulangi langkah 13 14 untuk puncak contoh sebenarnya sekarang. Kami memilih puncak ini secara terpisah dari puncak pemuatan-kontrol sehingga area tersebut tidak diperhitungkan dalam perhitungan kerapatan protein kita yang menarik. Seperti sebelumnya, gunakan alat Wand untuk klik di dalam area puncak di jalur 1, lalu terus klik di dalam puncak jalur yang tersisa. Setelah selesai, masuk ke AnalyzegtGelgtLabel Peaks untuk menunjukkan hasilnya. Salin hasilnya ke spreadsheet di samping data untuk pita kontrol pemuatan (Gambar 17). Gambar 17. Hasil dari band kontrol pemuatan (berlabel 8220stds8221 di sini) dan puncak protein sampel (baris atas pita pada western western asli). Analisis Data dengan pita pengatur beban 1. Dengan semua nilai kerapatan relatif sekarang dalam spreadsheet, kita dapat menghitung jumlah protein relatif pada lapisan barat. Ingat bahwa nilai 8220Area8221 dan 8220Percent8221 yang dikembalikan oleh ImageJ dinyatakan sebagai nilai relatif, hanya didasarkan pada puncak yang Anda sorot pada gel. Mulailah analisis dengan menghitung nilai Densitas Relatif untuk masing-masing pita standar pemuatan. Dalam kasus ini, kita akan berpura-pura bahwa Lane 1 adalah kendali kita sehingga kita ingin membandingkan 3 jalur lainnya. Bagilah nilai Persen untuk setiap jalur dengan nilai Persen dalam kontrol (Lane 1 di sini) untuk mendapatkan satu set nilai kerapatan yang relatif terhadap jumlah protein pada pita kontrol beban Lane 18217 (Gambar 18). Gambar 18. Hitung nilai Densitas Relatif dengan membagi nilai Persen di setiap baris dengan sampel kontrol8217s Nilai Persen (Lane 1, 40.828, pada contoh kita). 2. Selanjutnya kita akan menghitung nilai Densitas Relatif untuk pita protein sampel kami (baris atas pada contoh western blot). Kami melakukan perhitungan yang sama seperti langkah 1, membagi nilai Persen di setiap baris dengan nilai Persen pita protein kontrol kami (Lane 1 di sini). Gambar 19. Hitung nilai Densitas Relatif untuk Sampel juga, dengan menggunakan nilai Persen untuk pita protein kontrol Anda (Lane 1, 40.585 di sini). Catatan: Ingatlah bahwa karena beberapa band pemroses muatan kami sangat berbeda dengan blot barat yang asli, kami hanya dapat menggunakan nilai Densitas Relatif dari Sampel kami yang dihitung pada Langkah 2 sebagai hasil akhir. Sekarang perlu untuk mengukur nilai Densitas Relatif untuk Sampel dengan Kerapatan Relatif dari pita pemroses pemuatan yang sesuai untuk setiap jalur. Kami melakukan ini berdasarkan asumsi bahwa perbedaan proporsional pada Kerapatan Relatif pada pita kontrol pengepres mewakili perbedaan proporsional dalam jumlah total protein yang kami muat pada gel. Dalam contoh western blot kita, kita memiliki bukti jumlah protein total dalam jumlah besar pada setiap sampel (praktik pipet yang buruk, mungkin). 3. Langkah terakhir adalah untuk mengukur Sampel Relatif Densitas kita dengan menggunakan Densitas Relatif dari kontrol pemuatan. Pada spreadsheet, bagilah Sampel Relative Density dari masing-masing jalur oleh load-control Relative Density untuk jalur yang sama. Gambar 20. Nilai Densitas Disesuaikan (sel kuning) untuk sampel kami dihitung dengan membagi Kerapatan Relatif dari masing-masing jalur Sampel dengan Kerapatan Relatif dari kontrol pemuatan untuk jalur yang sama. Misalnya, Relative Density for Sample 4 (0.1628) dibagi dengan Relative Density untuk kontrol pemuatan di Lane 4 (0.154379) untuk mendapatkan nilai Disesuaikan Densitas 1,054. 4. Ketika kami membuat contoh imajiner kami, western western, kami memperkirakan jumlah protein yang sesuai untuk kepentingan masing-masing jalur, karena kami (secara hipotetis) mengisi sampel sampel setara dengan protein dari botol homogen yang sama di setiap jalur. Selama proses pemuatan, sesuatu menjadi kacau, dan kerapatan kami sangat berbeda di noda barat. Tapi setelah melakukan koreksi pemuatan di atas, kami menemukan bahwa Densitas Adjusted kami untuk masing-masing dari 4 jalur kira-kira setara (semuanya kira-kira 1), yang menunjukkan bahwa ada rasio setara protein yang dikandung di dalam sampel total Protein di setiap jalur, seperti yang kita harapkan. Contoh di atas merupakan kasus khusus. Pada kenyataannya, Anda biasanya cukup terampil untuk memasukkan jumlah protein total ke dalam jalur gel Anda, mungkin karena Anda telah menggunakan proses seperti Protein Assay BCA untuk mengukur jumlah protein yang ada di masing-masing sampel homogen Anda. Hal ini dapat meniadakan kebutuhan akan pita kontrol pemuatan dan kontroversi terkait tentang apakah protein yang Anda gunakan untuk menilai pemuatan sama benar-benar dinyatakan secara konsisten di semua tingkat perawatan. Memperluas contoh ke beberapa lapisan barat Jika Anda dapat menerapkan jumlah protein total yang sama ke setiap jalur gel, Anda hanya perlu memperhatikan sampel standar yang sesuai yang ada pada masing-masing lapisan barat yang Anda jalankan untuk proyek ini. Misalnya, Anda bisa membeli aliquot dari Hsp70 yang dimurnikan dan menempatkan 1l di jalur pada setiap gel yang Anda jalankan saat menyelidikinya untuk Hsp70. Atau Anda bisa menghemat sejumlah uang dengan membuat sampel standar Anda sendiri dengan mencampur aliquot beberapa homogenat Anda untuk membuat sejumlah besar homogenasi campuran yang dapat Anda gunakan untuk memuat volume standar ke satu jalur setiap gel untuk keseluruhan proyek Anda (berjalan Dari campuran ini bagian jalan melalui proyek Anda akan menjadi Bad Thing). Dalam kasus ini, Anda mungkin tidak tahu konsentrasi protein yang benar dari minat pada homogenasi campuran Anda, tapi setidaknya Anda bisa mendapatkan jumlah protein total yang setara (termasuk protein yang diminati) pada setiap gel. Tujuan sampel standar adalah memperhitungkan variasi efisiensi pengikatan antibodi (misalnya jika Anda menggunakan kembali campuran antibodi pada banyak lapisan barat untuk menghemat uang), untuk variasi pemblokiran dan efisiensi pencucian, untuk variasi tingkat peluruhan Dari reagen chemiluminescent yang digunakan untuk memvisualisasikan antibodi, atau untuk variasi pada waktu pemaparan film x-ray Anda. Dalam kasus ini, intensitas sinyal yang Anda keluarkan dari blot barat Anda bisa bervariasi dari blot sampai blot (Gambar 21). Anda dapat menggunakan sampel standar pada setiap gel untuk menormalkan setiap band lain pada noda yang sama, dan kemudian membandingkannya dengan beberapa titik karena setiap pita pada dataset Anda dinormalisasi dengan standar yang sama (baik itu 10ng dari Hsp70 Manusia atau campuran beberapa homogenat ). Gambar 21. Dua contoh western blots dengan sampel standar umum (Lane 1). Langkah-langkah bindingincubationdevelopment dari dua lapisan ini sedikit bervariasi, menghasilkan pemaparan akhir yang berbeda yang mengubah kepadatan absolut pada dua titik. Karena kita memiliki sampel standar pada kedua lapisan, yang merupakan volume identik dari sampel protein yang identik (yaitu diambil dari aliquot umum homogenat), kita dapat mengekspresikan kepadatan jalur lainnya pada setiap gel relatif terhadap sampel standar, menghilangkan Efek dari eksposur yang berbeda. Akhirnya, jika Anda menggunakan pita protein pengontrol muatan (baris bawah pada titik-titik ini) pada setiap gel, dan sampel protein standar pada beberapa gel, Anda dapat memperbaiki keduanya untuk perbedaan total protein yang dimuat di jalur (menggunakan pemuatan - Control band) dan untuk perbedaan eksposur antara gel (menggunakan sampel standar). Misalnya, perhatikan dua gel pada Gambar 21. Gel 1 (putih) memiliki noise latar belakang yang minimal, dan ada beberapa variasi jumlah protein yang dimuat di masing-masing jalur, seperti yang ditunjukkan oleh ukuran dan kerapatan pita kontrol pemuatan dari Sampel Jalur pertama di sebelah kiri adalah sampel standar yang digunakan pada masing-masing gel. Gel 2 (abu-abu) memiliki lebih banyak kebisingan latar belakang karena waktu pemaparan yang berbeda, pencucian yang buruk, atau sejumlah masalah yang mungkin terjadi. Sekali lagi, ada jumlah protein yang berbeda yang dimuat di 4 jalur, berdasarkan ukuran dan densitas pita pemuatan di bagian bawah. Jalur pertama di sebelah kiri adalah sampel protein standar yang sama seperti yang digunakan pada gel pertama. Kita akan mulai dengan menganalisis dua gel secara terpisah, dengan menggunakan protokol di bagian kontrol pemuatan dokumen ini. 1. Hitung kerapatan relatif pita pemuatan (baris bawah pada gel ini). Gunakan pita pemuat untuk standar di jalur 1 untuk melakukan perhitungan ini. 2. Hitung kerapatan relatif band untuk pita protein yang diminati (baris atas pada gel ini). Gunakan pita protein yang diminati untuk standar di jalur 1 untuk melakukan perhitungan ini. 3. Sesuaikan kerapatan relatif yang dihitung pada Langkah 2 dengan menggunakan kerapatan relatif untuk pita pengontrol beban yang dihitung pada Langkah 1. Cukup bagilah kerapatan relatif dari Langkah 2 untuk setiap jalur dengan kerapatan relatif yang sesuai dari Langkah 1. Setelah Anda mengukur kerapatan Dari protein yang menarik untuk setiap sampel dengan sampel standar, dan menyesuaikan kerapatan relatif berdasarkan pita pemuatan, Anda ditinggalkan dengan perkiraan kerapatan relatif protein yang diminati di setiap jalur pada gel Anda (relatif terhadap Standar di jalur 1). Ulangi ini untuk masing-masing gel yang terpisah. Setelah selesai, Anda akan tahu bahwa karena setiap jalur sampel dinormalisasi dengan sampel standar di Lane 1 pada gel tertentu, dan setiap gel mengandung sampel standar yang sama, perbandingan silang Anda sudah tercapai, karena setiap sampel sekarang dinormalisasi ke Sampel standar yang sama (Gambar 22). Gambar 22. Contoh data dari dua western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.